G. I joe: the rise of cobra mengawali kisahnya di prancis, tahun 1641. Klan mccullen dituduh menjual persenjataan pada scotlandia dan prancis. Daripada mengeksekusi untuk alasan tersebut, juri pengadilan memutuskan untuk memberi tanda di wajahnya dengan topeng untuk mempermalukannya. Di masa depan, seorang ahli senjata, james mccullen (christopher eccleston) menciptakan senjata berbasiskan nano-teknologi yang dapat menghancurkan seluruh kota. Perusahannya, mars, menjual senjata tersebut pada nato dan angkatan bersenjata amerika. Duke (channing tatum) dan ripcord (marlon wayans) sedang mengantarkan senjata tersebut ketika mereka diserang oleh the baroness (sienna miller) yang mana merupakan mantan tunangan duke, ana lewis. Duke dan ripcord diselamatkan oleh scarlett (rachel nichols), snake eyes (ray park) dan heavy duty (adewale akinnuoye-agbaje). Mereka menyerahkan senjata tersebut pada the pit, pemimpin g. I. Joe di afrika utara.
Mccullen kemudian diketahui menggunakan nano-teknologi yang sama untuk membentuk pasukan dengan bantuan doctor (joseph gordon-levitt), merencanakan untuk menggunakan senjata tersebut untuk menciptakan kerusuhan dan pemerintahan dunia yang baru. Menggunakan alat pelacak, mccullen melacak lokasi markas g. I. Joe dan mengirimkan storm shadow (lee byung-hun) dan the baroness untuk mendapatkan kembali senjata dengan bantuan dari zartan (arnold vosloo). Setelah perkelahian yang tak terelakkan, baroness menyerahkan senjata kepada baron decobray, suami the baroness yang digunakan untuk menghancurkan menara eiffel.
G. I. Joe kemudian menemukan markas rahasia dan meluncur kesana setelah mccullen mengisi tiga missil dengan senjata nano. Perkelahian kembali terjadi antara pihak g. I. Joe dan mccullen. Setelah snake eyes mengeluarkan nano-mite dari dalam missil, ripcord mencari missil yang tersisa di prototype jet night raven. Ketika scarlett dan snake eyes berusaha untuk mematikan markas arctic, heavy duty meyerang angkatan cobra, sedangkan duke yang berkelahi dengan the doctor, mengetahui bahwa the doctor adalah rex lewis, saudara laki-laki ana yang diduga meninggal dalam salah satu misi yang dipimpin oleh duke empat tahun yang lalu.
The baroness mencoba untuk menyelamatkan duke, tetapi the doctor mengatakan bahwa the baroness diimplan dengan nano-mite yang menyebabkan dia berada dalam kekuasannya selama 4 tahun ini. Berusaha untuk membunuh duke, mccullen terbakar ketika kabur bersama rex. Rex kemudian menyembuhkan luka bakar mccullen dengan nanomite dan menginformasikan identitas pemimpin cobra sebelum akhirnya ditangkap oleh g. I. Joe.
